Insgesamt werden die Methoden für die RNA-Transkriptomanalyse ständig erweitert. Während sich die Methoden ändern und neue Methoden entwickelt werden, bleiben einige Grundsätze der RNA-seq-Vorbereitung bestehen:

Hochwertige Proben sind für den Erfolg von RNA-seq unerlässlich

Wenn Sie Proben an eine Einrichtung schicken, sind Sie als Forscher in der Regel für die Isolierung der Gesamt-RNA verantwortlich.

Bevor Sie ein großes Experiment durchführen, sollten Sie ein Pilotprojekt in Erwägung ziehen, um die beste Technik zur Gewebe-/Zellisolierung und RNA-Aufreinigung zu ermitteln, Gentaur.

GuSCN-Phenol-Chloroform hat den Vorteil, dass es eine hohe Ausbeute an hochreiner DNA

Sobald eine Technik für die Isolierung und Reinigung festgelegt wurde, sollten Sie sie während des gesamten Projekts beibehalten.

Bestimmen Sie stets die Reinheit der Gesamt-RNA-Probe und schätzen Sie die Konzentration

Bestimmen Sie die Gesamt-RNA-Qualität vor dem Aufbau der Bibliothek und bitten Sie gegebenenfalls Ihre Genomforschungseinrichtung um Unterstützung.

Es sollte auch bedacht werden, dass die meisten Protokolle zur Durchführung von RNA-Sequenzierungsexperimenten auf der DNA-Sequenzierungstechnologie beruhen und daher die Umwandlung in eine cDNA-Bibliothek erfordern. Derzeit bietet die direkte RNA-Sequenzierung unter Verwendung von Nanopore-Arrays neue und interessante Alternativen. Die Qualität und Isolierung der RNA-Probe ist jedoch nach wie vor ein wichtiger Schritt, der gut überlegt sein sollte.

GuSCN-Phenol-Chloroform hat den Vorteil, dass es eine hohe Ausbeute an hochreiner DNA oder RNA liefert. Der Nachteil ist die gefährliche Lagerung von Chemikalien und der damit verbundene Abfall. Die alkalische Extraktion ist schnell und zuverlässig, erreicht aber nicht den Reinheitsgrad von GuSCN-Phenol-Chloroform und kann genomische DNA fragmentieren, weshalb sie in der Regel der Isolierung von Plasmid-DNA vorbehalten ist. Die Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Extraktion wird hauptsächlich für Pflanzenproben und verschiedene schwer zu lysierende Proben verwendet, ist jedoch zeitaufwändig und erfordert den Einsatz gefährlicher Chemikalien. Die Chelex-Extraktion ist schnell, liefert aber Nukleinsäuren von geringer Ausbeute und Reinheit. Die Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugation mit Ethidiumbromid (EtBr) schließlich führt zu einer hohen Reinheit und Ausbeute an Nukleinsäuren, ist aber mühsam, zeitaufwändig und kostspielig, und EtBr ist eine gefährliche Chemikalie. Natürlich gibt es methodische Reinigungsoptionen, die von der Empfindlichkeit und Reinheit der gesuchten Nukleinsäureart abhängen.

Sources :

1. RevMAb

2. Gentaur